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一種鉀離子通道蛋白基因、其編碼的蛋白及其應用.pdf

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一種 離子 通道 蛋白 基因 編碼 及其 應用
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摘要
申請專利號:

CN201310150471.6

申請日:

2013.04.26

公開號:

CN103215279B

公開日:

2014.10.29

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 15/29申請日:20130426|||公開
IPC分類號: C12N15/29; C12N15/63; C12N1/21; C07K14/415; A01H5/00; C12R1/01(2006.01)N 主分類號: C12N15/29
申請人: 大連理工大學
發明人: 蘇喬; 商玲
地址: 116024 遼寧省大連市高新園區凌工路2號
優先權:
專利代理機構: 大連東方專利代理有限責任公司 21212 代理人: 賈漢生;李馨
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310150471.6

授權公告號:

103215279B||||||

法律狀態公告日:

2014.10.29|||2013.08.21|||2013.07.24

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明屬于生物技術領域,具體公開一種鉀離子通道蛋白基因、其編碼蛋白及該基因在植物鉀吸收及耐鹽性方面的應用。本發明的基因來源于鹽角草,命名為SeAKT1,該基因具有K+吸收功能,能提高轉基因擬南芥在3mM和100μM?K+環境中K+利用率,是一種雙親和性鉀通道蛋白。這預示著它在農作物鉀高效利用方面的應用價值,可減少鉀肥的施用,從而降低生產成本。該基因也能提高轉基因擬南芥在缺鉀及鹽脅迫條件的K+吸收能力,同時減少對Na+的攝入,提高了K+/Na+,從而提高了植物的耐鹽性。這種提高轉基因植物的耐土壤低鉀和耐鹽的特性,可通過轉基因技術應用于農作物上,從而應對日益嚴重的土壤低鉀和鹽漬化問題。

權利要求書

權利要求書
1.   一種鉀離子通道蛋白基因,其特征在于,該基因具有下列核苷酸序列之一:
①該基因具有序列表中SEQ ID NO.17或其自5’端38~2614位所示的堿基序列;
②該基因與序列表中SEQ ID NO.17或其自5’端38~2614位所示的堿基序列具有95%以上的同源性,且編碼相同蛋白質的堿基序列。

2.   一種鉀離子通道蛋白,其特征在于,該蛋白由序列表中SEQ ID NO.18的氨基酸殘基序列組成。

3.   一種鉀離子通道蛋白衍生蛋白質,其特征在于,該蛋白由序列表中SEQ ID NO.18的氨基酸殘基經過一個或幾個氨基酸殘基取代、缺失或添加而產生的具有相同的生物學功能的衍生蛋白質的氨基酸序列。

4.   一種含有權利要求1所述的鉀離子通道蛋白基因的重組表達載體。

5.   根據權利要求4所述的重組表達載體,其特征在于,其表達載體為pBI121。

6.   一種含有權利要求4或5所述重組表達載體的宿主細胞。

7.   根據權利要求6所述的宿主細胞,其特征在于,該宿主細胞為根癌農桿菌GV3101菌株。

8.   如權利要求1所述的基因在提高轉基因植物在不同鉀濃度環境下K+的利用率方面的應用。

9.   如權利要求1所述的基因在提高轉基因植物在低鉀和鹽脅迫環境下K+的利用率和耐鹽性方面的應用。

說明書

說明書一種鉀離子通道蛋白基因、其編碼的蛋白及其應用
技術領域
本發明屬于生物技術領域。本發明涉及一種鉀離子通道蛋白基因、其編碼的蛋白及該基因在植物鉀高效利用和耐鹽性方面的應用。
背景技術
鉀是植物生長所必需的大量營養元素之一,廣泛分布于植物的各組織和器官,是植物細胞內含量最豐富的一價陽離子。鉀在植物眾多生理功能中發揮著重要的作用,如維持細胞離子平衡、調節細胞膨壓、調節各種酶的活性以及參與蛋白質合成等,維持高并且相對穩定的鉀含量對植物生長至關重要。植物缺鉀會出現明顯的缺鉀癥狀,表現為易倒伏,葉片易失水,耐旱耐鹽性降低,葉片發黃和組織壞死等。耕地土壤缺鉀會導致農作物產量和品質大幅下降。因此,維持植物生長過程中鉀營養供給十分重要。我國的大部分耕地供鉀不足,其中嚴重缺鉀土地約2000萬公頃,占耕地總面積的20%以上。并且,我國鉀礦資源匱乏,鉀肥的年產量十分有限,缺鉀狀況嚴重影響著我國農業的發展。
同時,土壤鹽漬化是一個全球性的生態問題。過量的鈉離子對植物的成長具有毒害作用,大部分農作物在鹽脅迫狀態下不能正常生長,表現為發育遲緩,發芽率降低,器官生長和分化受到抑制,新陳代謝減緩等癥狀。土壤鹽漬化不僅會造成糧食減產,也是土地荒漠化和耕地退化的主要原因之一,嚴重制約著農業生產。
研究表明,不同種類的植物或同種植物的不同品種對土壤缺鉀和鹽脅迫的生理反應及對鉀的吸收利用效率存在明顯差異,并且這種差異性是可以遺傳的,說明植物這種性狀是由遺傳基因控制的。在高鹽環境下仍具有鉀吸收能力,進而維持高的K+/Na+比是決定植物的耐鹽性的關鍵因素。因此,植物鉀吸收能力與其耐鹽性息息相關。自從20世紀90年代以來,許多負責植物鉀吸收及轉運的鉀離子通道基因和鉀離子轉運蛋白基因被相繼克隆和鑒定。其中,鉀離子通道在植物鉀吸收中起著重要的作用,研究鉀離子通道基因,為我們深入認識和理解作物體內鉀的吸收及利用機制,進而提高鉀的有效利用率具有積極的作用。目前,已有一些植物的鉀離子通道被克隆并鑒定出來,如OsAKT1(水稻),AKT1(擬南芥),ZMK1(玉米),MIRK(甜瓜)和MKT1(冰葉日中花)等。然而這些基因大部分來自甜土植物,并且多數對Na+敏感,其中包括來自鹽生植物的MKT1。在土壤既缺鉀又有鹽漬化的情況下,只有對Na+不敏感的鉀轉運蛋白才能正常發揮功能,使轉基因作物既耐低鉀又耐鹽,因此考慮從真鹽生植物鹽角草中分離對Na+不敏感的鉀轉運蛋白基因。所以,本專利采用雙子葉鹽生植物鹽角草為實驗材料。
鹽角草(Salicornia europaea):一年生雙子葉草本植物,藜科鹽角草屬,一般生于鹽堿地、鹽湖旁及海邊。鹽角草屬植物是迄今為止報道過的地球上最耐鹽的陸生高等植物類群之一,其在600mM鹽濃度條件下也能吸收鉀離子,維持植物正常生長。(鹽角草種子采于大連市營城子海邊的鹽堿地,并于實驗室中種植,用含300mM NaCl的1/2Hoagland營養液定期灌溉。自然條件下培養)。
發明內容
為了解決上述問題,本發明公開一種鉀離子通道蛋白基因、其編碼蛋白及該基因在植物鉀吸收及耐鹽性方面的應用。該基因是從鹽角草中分離出來的,具有K+吸收功能,是一種雙親和性鉀通道蛋白。這預示著它在農作物鉀高效利用方面的應用價值,可減少鉀肥的施用,從而降低生產成本。該基因能提高轉基因擬南芥在缺鉀及鹽脅迫條件的K+吸收能力,同時減少對Na+的攝入,提高了K+/Na+,從而提高了植物的耐鹽性。這種提高轉基因植物的耐土壤低鉀和耐鹽的特性,可通過轉基因技術應用于農作物上,從而應對日益嚴重的土壤缺鉀和鹽漬化問題。
本發明的技術方案如下:
本發明的目的之一在于提供具有鉀吸收功能的鉀離子通道蛋白基因,該基因是從鹽角草中分離出來的,具有下列核苷酸序列之一:
①該基因具有序列表中SEQ ID NO.17或其自5’端38~2614位所示的堿基序列;
②該基因與序列表中SEQ ID NO.17或其自5’端38~2614位所示的堿基序列具有95%以上的同源性,且編碼相同蛋白質的堿基序列。
本發明的目的之二在于提供了具有上文所述鉀離子通道蛋白的編碼蛋白,該蛋白由序列表中SEQ ID NO.18的氨基酸殘基序列組成;且提供了該鉀離子通道蛋白的衍生蛋白質,即由序列表中SEQ ID NO.18的氨基酸殘基經過一個或幾個氨基酸殘基取代、缺失或添加而產生的具有相同的生物學功能的衍生蛋白質的氨基酸序列。
本發明的目的之三在于提供一種重組表達載體,該重組表達載體上含有上文所述的鉀離子通道蛋白基因;且在優選的技術方案中,是以pBI121作為表達載體,本發明的實施例中,具體公開了重組載體的構建方法和鑒定方法。
本發明的目的之四在于提供一種含有上文所述重組表達載體的宿主細胞;且在優選的技術方案中,該宿主細胞為根癌農桿菌GV3101菌株,本發明的實施例中,具體公開了根癌農桿菌GV3101為宿主菌的實驗方法。
本發明的目的之五在于提供上文所述的鉀離子通道蛋白基因在提高轉基因植物在不同鉀濃度環境下K+的利用率方面的應用;以及該基因在提高轉基因植物在低鉀和鹽脅迫環境下K+的利用率和耐鹽性方面的應用;尤其在優選的技術方案中,該基因在改良擬南芥性狀中有較好的應用效果。
總之,本發明的基因SeAKT1具有鉀離子通道蛋白的功能,本發明的實施例證明它能提高轉基因擬南芥在3mmol和100μmol濃度K+環境下的K+吸收效率和在缺鉀、鹽脅迫下的K+吸收能力,提高K+/Na+,進而提高植物鉀利用效率及耐鹽性,同時也預示著它在農作物鉀高效利用和耐鹽性方面的應用價值。
附圖說明
圖1為SeAKT1基因克隆PCR電泳圖。其中,A為保守區部分片段克隆;B為3’端部分片段克隆;C為5’端部分片段克隆;D為ORF全長PCR電泳圖。M1:DL2000marker;M2:λ?EcoT14marker。圖中結果顯示:A:克隆所得保守區片段長度約為750bp;B:克隆所得3’端片段約為2000bp;C:克隆所得5’端片段長度約為800bp;D:SeAKT1開放性閱讀框長度為2577bp。將上述克隆所得序列測序后進行blast比對,結果表明所得片段均與Shaker家族鉀離子通道基因存在較高同源性。
圖2為本發明的SeAKT1基因編碼的蛋白的結構圖。圖中結果顯示該基因具有S1?S6六個跨膜結構域,cNMP結合位點及ANK結構域。從而表明SeAKT1是典型的Shaker家族內向整流型鉀離子通道。
圖3為本發明的鉀通道蛋白SeAKT1疏水性分析圖。圖中結果顯示該蛋白具有S1?S6六個跨膜結構域,cNMP結合位點及ANK結構域,從而表明SeAKT1是一個跨膜蛋白,并具有Shaker家族鉀離子通道蛋白的一般結構特征。
圖4為本發明的SeAKT1基因編碼的蛋白的進化分析圖。圖中結果顯示該基因與AKT1亞族中的Mktp1和NKT1等親緣關系較近,表明該編碼蛋白屬于鉀離子通道蛋白家族的AKT1亞族。(鉀離子通道SeAKT1的氨基酸序列采用ClustalX程序預測,并采用MEGA5軟件構建進化樹。AKT1/2/5,KAT1/2,AtKC1和GORK/SKOR?擬南芥;SPIK,PeKC1/2?楊樹;NKT1?煙草;RCAKT1/2/3/6?蓖麻;Mktp1?冰葉日中花;DKT1?胡蘿卜;LKT1?西紅柿;TaAKT1?小麥;HvAKT1?大麥;PutAKT1?星星草;OsAKT1,OsKT2?水稻。)
圖5為不同處理下,SeAKT1半定量RT?PCR電泳圖。其中A為不同處理下幼苗中SeAKT1表達情況;B為不同處理下成苗中SeAKT1表達情況。其中A圖中1:未處理;2:缺鉀處理;3:100mM NaCl處理;4:缺鉀+100mM NaCl處理。B圖中1:未處理;2:缺鉀處理;3:700mM NaCl處理;4:缺鉀+700mM NaCl處理。結果表明,在缺鉀情況下幼苗和成苗中表達量均有所上調,尤其是幼苗中上調幅度尤為明顯;在缺鉀+鹽脅迫處理的情況下,幼苗(缺鉀+100mM Na+)和成苗(缺鉀+700mM Na+)中表達量都有所增加;在幼苗中100mMNa+處理下表達量上升而成苗中700mMNa+處理下表達量略有下調。據報道,AKT1類的鉀離子通道(如:MKT1、OsAKT1、AKT1)在外部濃度為400mM,150mM或者50mM的時候表達量劇烈下調,而SeAKT1在100mMNa+處理下的鹽角草幼苗中表達量上升,在700mMNa+處理下成苗中表達量只略微下降,相比之下具有明顯優勢。
圖6為重組植物表達載體pBI121?SeAKT1的結構圖譜。表明該基因可在35S啟動子的調控下組成型表達,重組載體具有卡那霉素抗性。
圖7為轉SeAKT1基因擬南芥植株的卡那霉素篩選圖。a:野生型擬南芥未加卡那霉素篩選;b:轉基因擬南芥加卡那霉素篩選;c:野生型擬南芥加卡那霉素篩選;圖示的結果證明轉SeAKT1基因陽性苗具有卡那霉素抗性,可在卡那霉素下正常生長;而野生型擬南芥則只長出兩片子葉,無法繼續長出真葉,并逐漸枯萎變黃,直至死亡。
圖8為本發明SeAKT1基因的轉基因擬南芥在不同處理條件下的K+、Na+含量及K+/Na+情況。WT:野生型擬南芥;SeAKT1:轉SeAKT1基因擬南芥;Control:正常MS培養基;?K:缺K+MS培養基;+Na:75mM Na+MS培養基;?K/+Na:缺K++75mM Na+MS培養基。結果顯示:與對照組相比,處理條件下轉基因擬南芥與野生型擬南芥根和冠(地上部分)中鉀含量均有所下降,但轉SeAKT1基因擬南芥中鉀含量下降幅度更小一些;在Na+脅迫下,轉基因擬南芥和野生型擬南芥中的Na+含量均有較大幅度的升高,但相對而言,轉基因擬南芥根和冠中的Na+含量均低于野生型擬南芥;與對照組相比,在不同脅迫條件下轉基因和對照擬南芥根部和冠中的K+/Na+均有明顯降低,但轉基因擬南芥的K+/Na+要明顯高于野生型擬南芥。表明SeAKT1基因可以使脅迫條件下的轉基因擬南芥吸收更多的K+,并且減少對Na+的攝入,從而使細胞內維持相對較高的K+/Na+,保證植株正常生長代謝,提高了植物的耐低鉀和耐鹽性。
圖9為本發明SeAKT1基因的轉基因擬南芥在3mmol濃度K+環境下的K+耗竭實驗。圖中結果顯示在3mmol濃度K+環境下,轉SeAKT1基因擬南芥耗竭液中K+濃度下降的更快,并且終濃度更低。表明轉基因擬南芥在毫摩爾濃度K+環境下K+吸收效率有所提高。
圖10為本發明SeAKT1基因的轉基因擬南芥在100μmol濃度K+環境下的K+耗竭實驗。圖中結果顯示在100μmol濃度K+環境下,轉SeAKT1基因擬南芥耗竭液中K+濃度下降的更快,并且終濃度更低。表明轉基因擬南芥在微摩爾濃度K+環境下K+吸收效率有所提高。
具體實施方式:
下面結合具體實施例,進一步闡述本發明。應理解,這些實例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的應用范圍。
下面實施例中未注明具體實驗條件的試驗方法,通常按照常規條件或分子克隆中所述條件,或按照產品說明書上所提供的條件。
下面是實例中所用的材料、試劑等如無特殊說明,均可從商業途徑得到。
實施例一SeAKT1基因cDNA的克隆與分析
一鹽角草總RNA提取
稱取50mg新鮮鹽角草組織,于液氮中研磨成粉末,將研磨好的材料迅速轉移至含有1ml trizol試劑的離心管中,震蕩混勻;加入0.2ml氯仿,劇烈震蕩15s,室溫放置5min;4°C12000r/min,10?15min,取上清;將上清轉移至新的離心管中;加入0.5ml異丙醇,混勻,室溫10min;4°C,12000r/min,離心10min;棄上清,加入1ml冰預冷的70%乙醇(新鮮配制),洗滌沉淀;4°C,7500r/min,5min;棄上清,室溫晾干(勿太干),加入20μl RNase?free ddH2O,充分溶解RNA,?70°C保存備用。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取的質量。結果呈現了28S、18S、5S三種典型的RNA帶型,各條帶清晰,無明顯的拖尾現象,表明提取的RNA無明顯降解,可進一步用于RT?PCR實驗。
二單鏈cDNA的獲得
以提取的鹽角草總RNA為模板(500ng),按照寶生物Reverse Transcriptase M?MLV反轉錄說明書進行反轉錄反應,得到的單鏈cDNA可直接用于2nd?Strand cDNA的合成或者PCR擴增等。
三鹽角草SeAKT1基因部分編碼區的獲得
①簡并引物設計。根據NCBI上提供的冰葉日中花、煙草、擬南芥、水稻和大麥等植物的AKT1家族基因序列進行同源性比對,在其高度保守區設計一對簡并引物AKF(SEQ ID NO.1)/AKR(SEQ ID NO.2)。此簡并引物中Y=C/T,D=A/G,W=A/T,R=A/G。
②PCR擴增。以反轉錄獲得的單鏈cDNA為模板,AKF(SEQ ID NO.1)和AKR(SEQ ID NO.2)為引物,PCR擴增SeAKT1通道基因部分編碼區。反應體系如下:

PCR反應條件如下:先94℃(5min);再94℃(30s),50℃(40s),72℃(1min),35個循環;最后72℃(10min)。將PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離(結果如圖1A),至溴酚藍指示帶位于凝膠2/3處,在紫外燈下切下750bp區域的凝膠放入1.5mL離心管中,用TaKaRa公司(大連)的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0回收試劑盒進行回收。
③回收DNA片段連接、轉化與測序。采用寶生物pMD18?T vector試劑盒,將回收后的PCR產物直接與T載體相連,反應體系如下:

反應條件為16℃保溫過夜連接,連接產物用于大腸桿菌轉化。PCR及酶切檢測獲得片段長度約750bp的陽性克隆,送測序。測序結果見SEQ ID NO.14。將測序結果在NCBI上進行Blast?N比對顯示:該序列與冰葉日中花MKT1,擬南芥AKT1,水稻OsAKT1,小麥TaAKT1和大麥HvAKT1基因序列的同源性分別達到69%,61%,57%,57%和53%。初步推斷此cDNA片段是鹽角草鉀離子通道基因編碼區的部分序列。
四RACE法克隆鹽角草SeAKT1基因3’cDNA
①3’RACE特異引物的設計。根據已獲得的鹽角草SeAKT1基因部分cDNA片段以及TaKaRa(大連)公司的3’?full RACE Kit提供的引物3’RACE Outer Primer/3’RACE Inner Prime(表1)設計一對嵌套PCR引物:3′正向特異性外側引物3?GSP1(SEQ ID NO.3),巢式特異性內側引物3?GSP2(SEQ ID NO.4)。
②巢式PCR反應。Outer PCR反應用外側引物3?GSP1(SEQ ID NO.3)和3’RACE Outer Primer進行外側擴增。反應體系如下:

PCR反應條件如下:先94℃(5min);再94℃(30s),55℃(40s),72℃(2min),35個循環;最后72℃(10min)。
Inner PCR反應以外側PCR產物為模板,用內側引物3?GSP2(SEQ ID NO.4)和3’RACE Inner Primer引物進行巢式擴增。反應體系如下:


PCR反應條件如下:先94℃(5min);再94℃(30s),55℃(40s),72℃(2min),35個循環;最后72℃(10min)。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離(結果如圖1B)、切膠回收、連接克隆載體、轉化大腸桿菌感受態、PCR及酶切檢測(方法同上),選取長度為2000bp的陽性克隆送測序。測序結果見SEQ ID NO.15。測序結果通過NCBI數據庫做Blast?N比對,結果顯示:該序列與冰葉日中花MKT1,蓖麻RcAKT1,煙草NKT1和楊樹SPIK基因序列的同源性較高。初步推斷此cDNA片段是鹽角草鉀離子通道基因3’端部分序列。
五錨定PCR法克隆SeAKT1基因5’cDNA
本實施例中SeAKT15’cDNA序列采用錨定PCR方法獲得。步驟如下:根據已克隆得到的SeAKT1基因保守區序列設計2條特異性巢式引物,以鹽角草總RNA反轉錄成的cDNA為模板,用外側特異性引物5?GSP1(SEQ ID NO.5)為引物進行單引物擴增,在末端轉移酶(TdT)的作用下,在單鏈擴增產物的3’末端加上寡聚鳥嘌呤Oligo d(G),以加尾產物為模板,利用特異性引物5?GSP2(SEQ ID NO.6)、5?GSP3(SEQ ID NO.7)和Oligo d(C)為正反向引物對加尾的產物進行PCR擴增,將PCR結果電泳,切取目標條帶回收測序,并鑒定。
①單引物擴增
以反轉錄產生的鹽角草單鏈cDNA為模板,首先以5?GSP1(SEQ ID NO.5)為引物進行單引物擴增,反應體系和反應條件如下:

PCR反應條件如下:先94℃(5min);再94℃(30s),57℃(40s),72℃(1min),35個循環;最后72℃(10min)。
②加尾反應
將以上PCR產物用于加尾反應。混勻反應液,于37℃溫浴3h。20μl反應體系如下:

③巢式PCR擴增
以上述加尾產物為模板,Oligo(dC)15為正向引物,先后以特異性巢式引物5?GSP2(SEQ ID NO.6)、5?GSP3(SEQ ID NO.7)為反向引物進行巢式PCR反應。PCR反應體系如下:

PCR反應條件如下:先94℃(5min);再94℃(30s),58℃(40s),72℃(1min),35個循環;最后72℃(10min)。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離(圖1C)、切膠回收,連接克隆載體,轉化大腸桿菌感受態,PCR及酶切檢測片段長度,方法同上,檢測長度約為800bp的陽性克隆送測序。測序結果見SEQ ID NO.16。通過NCBI數據庫對測序結果進行Blast?N比對,結果顯示:該序列與冰葉日中花MKT1,葡萄VvAKT1,胡蘿卜DKT1和蓖麻RcAKT1基因序列的同源性較高,初步推斷此cDNA片段是鹽角草鉀離子通道基因5’端部分序列。
5SeAKT1基因全長cDNA獲得
將上述SeAKT1通道基因保守區、3’端和5’端片段進行拼接,得到3189bp的cDNA序列(SEQ ID NO.17),其中包括5′端非編碼區37bp,3′端非編碼區576bp,編碼區2577bp,即自SEQ ID NO.17序列的5’端38位起始密碼子ATG,至2614位終止密碼子TGA的堿基序列,為2577bp的SeAKT1編碼區,其編碼一個由858個氨基酸構成的蛋白,將此鉀離子通道蛋白命名為SeAKT1(SEQ ID NO.18);以鹽角草cDNA為模板,根據拼接所得全長序列設計編碼區全長引物SeAKT1?S(SEQ ID NO.8)/SeAKT1?A(SEQ ID NO.9),PCR獲得該基因完整ORF的cDNA序列,長度為2577bp(如圖1D)。酶切及PCR檢測,選取3個長度為2577bp的陽性質粒測序,得到2577bp的SeAKT1編碼區。測序表明此全長序列與拼接序列完全相同。
6生物信息學分析
利用在線expasy軟件(http://web.expasy.org/protscale/)對SeAKT1進行疏水性分析,結果表明SeAKT1具有多個跨膜結構域,是一個跨膜蛋白(圖3)。系統發育樹分析表明SeAKT1是典型的Shaker家族內向整流型鉀離子通道(圖4),與已報道的冰葉日中花、擬南芥、大麥、水稻等植物鉀離子通道蛋白氨基酸序列同源性在39%~69%之間。
表1SeAKT1PCR擴增引物
名稱引物堿基序列(5’??3’)AKF(SEQ ID NO.1)AAYATGCTTCGYCTDTGGCGTCT
AKR(SEQ ID NO.2)AARTCWGTBGGYGCTTCRTTCTGC3?GSP1(SEQ ID NO.3)TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3?GSP2(SEQ ID NO.4)GCCTGCAAGATCAAATGCTTTCTCACT3’RACE Outer PrimerTACCGTCGTTCCACAGTGATTT3’RACE Inner PrimerCGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG5?GSP1(SEQ ID NO.5)AGAGACAGAATACAAGCTGCTTCAA5?GSP2(SEQ ID NO.6)GTCAATAACCACGCTCACAACAGT5?GSP3(SEQ ID NO.7)ATTATCGTGACCCGGAACAGACTTGOilgod(C)15CCCCCCCCCCCCCCCSeAKT1?S(SEQ ID NO.8)GCTCTAGAATGGATGCTTGGTTTAATTCACSeAKT1?A(SEQ ID NO.9)GCGAGCTCTCATTGGTCATTACAAGTG
實施例二 不同處理條件下SeAKT1表達量分析
鹽角草幼苗發芽一周后,轉入不同培養皿中處理48h。培養皿底部鋪入4層濾紙,并分別以正常、缺鉀(以Ca2+替代)、100mM NaCl和缺鉀+100mM NaCl的1/2Hoagland營養液潤濕。鹽角草發芽四周后,選取長勢一致的成苗5×4棵,分別轉入4個水培容器中處理48h。水培容器分別加入等體積的正常、缺鉀(以Ca2+替代)、700mM NaCl和缺鉀+700mM NaCl的1/2Hoagland營養液,并定期通氣。
48h后分別稱取經不同處理的0.05g長勢一致的鹽角草幼苗和成苗提取總RNA,合成cDNA,方法同實施例一。以內參基因Actin為對照,進行RT?PCR,引物堿基序列見表2。
表2半定量RT?PCR擴增引物
名稱引物堿基序列D?s(SEQ ID NO.10)5’AAGAACACCTATCTCCCCACAT3’D?a(SEQ ID NO.11)5’CAATAACCACGCTCACAACAGT3'Actin?s(SEQ ID NO.12)5’ATGGCATCACACTTTCTACAACAG3’Actin?a(SEQ ID NO.13)5’GGATGCAAGGATTGATCCTCCGATC3’
選擇適合的PCR擴增循環數,一方面保證可在瓊脂糖凝膠電泳中觀察到PCR產物,另一方面保證PCR擴增在達到平臺期之前,經過預實驗最終確定擴增循環數為27個循環。PCR擴增反應體系如下:


PCR反應條件如下:先94℃(5min);再94℃(30s),55℃(40s),72℃(1min),27個循環;最后72℃(10min)。此RT?PCR結果采用1%瓊脂糖電泳檢測,根據各條帶亮度判斷基因表達量的變化(圖5)。結果表明,在缺鉀情況下幼苗和成苗中表達量均有所上調,尤其是幼苗中上調幅度尤為明顯;在缺鉀+鹽脅迫的情況下,幼苗(缺鉀+100mM Na+)和成苗(缺鉀+700mM Na+)中表達量都有所增加;在幼苗中100mMNa+處理下表達量上升而成苗中700mMNa+處理下表達量略有下調。據報道,AKT1類的鉀離子通道(如:MKT1、OsAKT1、AKT1)在外部濃度為400mM,150mM或者50mM的時候表達量劇烈下調,而SeAKT1在100mMNa+處理下的鹽角草幼苗中表達量上升,在700mMNa+處理下成苗中表達量只略微下降,相比之下具有明顯優勢。(其中A為不同處理下幼苗中SeAKT1表達情況;B為不同處理下成苗中SeAKT1表達情況。其中A圖中1:未處理;2:缺鉀處理;3:100mM NaCl處理;4:缺鉀+100mM NaCl處理。B圖中1:未處理;2:缺鉀處理;3:700mM NaCl處理;4:缺鉀+700mM NaCl處理。)
實施例三轉SeAKT1基因擬南芥的獲得
一.SeAKT1基因植物表達載體構建
①pBI121表達載體質粒及pMD18T?SeAKT1質粒的提取。采用生工生物工程有限公司質粒小提試劑盒(SK8192)的操作步驟,提取質粒,具體方法見說明書。
②SeAKT1編碼區與表達載體連接片段的獲得。分別用XbaⅠ和SacⅠ對pMD18?SeAKT1和pBI121質粒雙酶切,以獲得2577bp SeAKT1編碼區片段和12947bp的pBI121載體大片段,用于連接。利用T4連接酶將以上兩個片段進行連接、轉化大腸桿菌DH5α,經PCR和酶切檢測后篩出長度正確的克隆,獲得了SeAKT1基因的植物重組表達載體pBI121?SeAKT1。酶切反應37℃溫浴過夜,反應體系如下:

③連接。回收酶切后的SeAKT1基因片段和pBI121大片段用TaKaRa T4DNA連接酶將二者連接。連接反應條件為16℃溫浴過夜,體系如下:


④采用熱擊法將連接液轉化大腸桿菌DH5α。PCR及酶切檢測,根據片段長度(2577bp)篩選出陽性克隆,
⑤陽性重組質粒轉化農桿菌。提質粒pBI121?SeAKT1,轉化農桿菌GV3101感受態。根癌農桿菌GV3101感受態細胞的制備方法如下:挑取GV3101單菌落于含有100mg/L利福平和100mg/L鏈霉素的YEB液體培養基中,28℃,180rpm振蕩培養過夜。取過夜培養的菌體按1:100的比例接種到50mL YEB液體培養基中,28℃,180rpm振蕩培養3?4h至細菌生長對數期OD600=0.5?0.6左右。取5mL菌液于4℃,4000rpm離心10min,沉淀用5mL預冷的TE(pH7.5)洗滌一次,加1mL新鮮的YEB培養基,重新懸浮,分裝,?70℃保存。
采用凍融法將質粒pBI121?SeAKT1導入農桿菌,方法如下:取一管(0.2mL)根癌農桿菌(Agribecterium tumefaciens)GV3101菌株感受態細胞置冰上融化,加入1μg質粒pBI121?SeAKT1,混勻,然后依次在冰上、液氮中及37℃水浴中放置5min,用YEB液體培養基稀釋至1mL,于28℃,180rpm振蕩培養2?4h;取適量菌液涂布于含有100mg/L利福平、50mg/L卡那霉素和100mg/L鏈霉素的YEB平板培養基上,28℃培養36h左右長出抗性菌落。PCR及酶切確定陽性克隆。
⑤花器浸泡法轉化擬南芥
首先,制備用于轉化的農桿菌菌液。以1:100比例接種農桿菌于有YEP培養液(YEP+100mg/L利福平+100mg/L鏈霉素+50mg/L卡那霉素)的試管中。28℃,200rpm搖過夜。次日早上將已活化的菌按1:100的比例加入250ml新鮮的YEB中繼續按上述條件培養,當OD600達到2.0左右時取出,4℃,4000rpm離心10min,收集菌體,倒掉上清,用250ml轉化液(1/2MS+50g/l蔗糖和0.5ml/LSilwet?77,用KOH調PH值為5.8)懸浮菌體,OD600為0.8左右。選取株高10?15cm左右,最大花序已產生一個角果的野生型擬南芥苗用于轉化,轉化前一天將苗澆透。將果莢及已開放的花朵全部剪掉,只留花蕾,用寬膠布把花盆的土封好。將準備好的擬南芥植株倒插入轉化液中,確保所有的花蕾都浸入農桿菌懸液中,順時針緩慢搖晃2min。標記好已轉化植株,將植株平放于避光盒子內,上蓋封口膜封好,避光培養2天后,將植株立起正常培養,收獲種子(轉入的當代為T0代,其收獲的種子為T1代轉基因種子)。
⑥轉基因擬南芥卡那霉素篩選(圖6)
于培養基中無菌篩選轉基因擬南芥植株。T1代轉基因擬南芥種子經過70%酒精(30s)和0.1%升汞(7min)消毒后種植于含50mg/L卡那霉素的MS培養基(MS+0.7%瓊脂+3%蔗糖,pH6.0)中,4℃暗培養2天,之后轉入光周期為16h/8h(光/暗),溫度為22℃?25℃的組培間培養。長出的陽性苗為T1代轉基因苗。同樣的方法獲得T2代轉基因擬南芥苗,用于生理檢測。
實施例四 SeAKT1在轉基因擬南芥中的K+、Na+含量測定。
MS培養基中生長的擬南芥苗發芽約一周左右,可篩選出陽性植株。以野生型擬南芥為對照,在正常MS培養基,缺鉀MS培養基,加75mM Na+的正常MS培養基和加75mM Na+的缺鉀MS培養基(培養基成分見表2)中生長,每皿20棵幼苗,豎直放置,7d后分別收獲根和冠。將待測的擬南芥根部和冠部組織置于恒溫干燥箱中,120℃殺青2小時,然后68℃烘干至恒重(24h),稱干重,置于100ml三角瓶中,用5mL濃硝酸與高氯酸混合液(4︰1,v/v)于暗室中消化一夜,高溫加熱使酸揮發干凈,冷卻至室溫,分別加入去離子水溶解,定容。原子吸收測鉀鈉含量。每個試驗設有三次重復。
實驗結果:與對照組相比,在缺鉀處理下轉基因擬南芥與野生型擬南芥根和冠中鉀含量均有所下降,但轉SeAKT1基因擬南芥中鉀含量下降幅度更小一些;在Na+脅迫下,轉基因擬南芥和野生型擬南芥中的Na+含量均有較大幅度的升高,但相對而言,轉基因擬南芥根和冠中的Na+含量均低于野生型擬南芥;與對照組相比,在不同脅迫條件下轉基因和對照擬南芥根部和冠中的K+/Na+均有明顯降低,但轉基因擬南芥的K+/Na+要明顯高于野生型擬南芥。
該實驗在轉基因擬南芥中驗證了鉀通道蛋白SeAKT1的功能,證明了脅迫條件下的轉基因擬南芥能吸收更多的K+,并且減少對Na+的攝入,從而使其根部和葉片K+/Na+均高于野生型煙草,提高了耐低鉀和耐鹽性。
表2培養基成分對照表(微量元素、鐵鹽、以及蔗糖、瓊脂加入量不變。)

實施例五SeAKT1在轉基因擬南芥中的鉀耗竭實驗
材料培養和饑餓處理:稱取實施例三中的轉基因擬南芥種子5mg,表面消毒、春化后播撒于MS培養基上,每皿兩排,光照培養6?7天(剛長出2片真葉),期間每天更換一次培養皿的位置,以使光照條件盡量一致;之后轉入裝有50mL饑餓液(200μMCaS04,0.5mM MES,用Tris調節pH至5.8)的三角瓶中鉀饑餓處理36小時,其間每隔12h更換一次饑餓液。所用的玻璃器皿用稀釋的硝酸浸泡后,清洗干凈。
饑餓液:5mM MES;200μM CaSO4;pH5.8(Tris調);
耗竭液:5mM MES;200μM CaSO4;pH5.8(Tris調),另加入100μM或3mM KCl;
以溶液耗竭法(Derw等,1984)進行各個株系的鉀吸收動力學測定、比較。取饑餓處理48小時后的植株,吸干表面水分,轉入裝有25ml含有3mM和100μM KCl耗竭液的三角瓶中,置于搖床上(150r/min)在與培養條件一致的環境中進行溶液耗竭?鉀吸收實驗。植株放入耗竭液中平衡5分鐘后開始取樣,每次取500μL耗竭吸收液,補入相同體積的超純水,使耗竭液的體積保持不變。直到耗竭液中鉀濃度維持穩定時結束取樣。
實驗結果顯示在3mM K+濃度下,隨著耗竭時間的增加,轉SeAKT1基因擬南芥和野生型擬南芥的耗竭液中的鉀離子濃度都在逐漸降低,即鉀離子都得到了吸收。然而,相比之下,轉基因擬南芥鉀離子濃度變化幅度更大,并且其耗竭液中鉀離子的終濃度也小于野生型擬南芥耗竭液(如圖9)。表明轉化SeAKT1基因的擬南芥具有低親和鉀吸收能力,能在外界毫摩爾級K+條件下更有效地吸收K+,維持植物的鉀素營養。
同樣,在100μM外部K+環境中轉基因擬南芥耗竭液中鉀離子濃度變化更大一些,24h后溶液中剩余鉀離子濃度也小于野生型擬南芥耗竭液(如圖10)。表明轉化SeAKT1基因的擬南芥具有高親和鉀吸收能力,能在外界毫微爾級K+條件下更有效地吸收K+的能力。

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本文標題:一種鉀離子通道蛋白基因、其編碼的蛋白及其應用.pdf
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